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BioDigital·青| 可以兼容qPCR體系的dPCR平臺

更新時(shí)間:2023-02-15      點(diǎn)擊次數:1477

新冠疫情爆發(fā)以來(lái),熒光定量PCR(qPCR)的核酸檢測已經(jīng)成為新冠確診的“金標準"。與免疫檢測相比熒光定量PCR具有較高的靈敏度,檢測窗口期較短,可以更早地確診是否病毒感染。qPCR是如何實(shí)現新冠定量的?首先,從咽拭子/鼻拭子中抽提獲得新冠的遺傳物質(zhì)RNA,然后通過(guò)qPCR儀定量出拭子中的RNA病毒載量,就可以確定是否是新冠感染者。

熒光定量PCR技術(shù)最主要的參數是擴增曲線(xiàn)的ct值,該值與被定量樣本的濃度存在一定數學(xué)關(guān)系,在qPCR定量中樣本的濃度對數值(log值)與擴增曲線(xiàn)的ct值呈線(xiàn)性關(guān)系,ct值越小,濃度越高。根據采用的定量數學(xué)模型的差異,qPCR的定量分為外標定量(外標法)和內標定量(內標法)兩種。外標法是定量過(guò)程中需要使用一系列已知濃度的外標定量標準品(4-5個(gè)濃度梯度),與待檢測的樣本同時(shí)檢測,通過(guò)標準曲線(xiàn)算出待檢測的樣本,該方法用的較多。內標定量指已知濃度的標準品(即定量?jì)葮耍?個(gè)濃度),與待檢測的樣本在同一管內擴增檢測,需要保證內標與檢測樣本的擴增效率一致,才能準確計算出待檢樣本的濃度。


qPCR外標定量(標準曲線(xiàn)法)

需要做標準品的梯度稀釋?zhuān)速M5-10個(gè)反應孔做標準曲線(xiàn),需同時(shí)擴增標準品和待檢測的樣本。

1)標準品和待檢樣本同時(shí)擴增,繪制標準曲線(xiàn);

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圖1.外標定量標準曲線(xiàn)繪制


2)數據分析

需要繁瑣的數據整理,將待檢樣本的ct值代入標準品標準曲線(xiàn)計算出未知樣本的濃度。

無(wú)論是外標定量,還是內標定量,qPCR技術(shù)的定量均需要采用已知濃度的標準品來(lái)實(shí)現未知濃度樣本的定量。然而,在實(shí)際情況中標準品和待檢樣本的性質(zhì)不會(huì )相同,很難保證待檢樣本和標準品的擴增效率達到一致。所以,qPCR定量的精準性會(huì )打折。盡管qPCR具有比免疫檢測技術(shù)更高的靈敏度,從新冠疫情的檢測過(guò)程中發(fā)現,qPCR技術(shù)需要做2-3次重復檢測,也會(huì )有一些無(wú)癥狀感染者轉陽(yáng)的案例,都是因為qPCR技術(shù)的靈敏度相對較低導致的。


外標法

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內標法

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圖2.熒光定量PCR定量方法


數字PCR技術(shù)(dPCR)是一種核酸絕對定量技術(shù),將反應體系均勻分配至2萬(wàn)個(gè)獨立的反應微孔中,每個(gè)單元包含0個(gè)、1個(gè)、個(gè)別有多個(gè)目標核酸分子,在每個(gè)反應單元中分別對樣品進(jìn)行擴增,擴增結束之后依據泊松分布原理對各個(gè)反應單元熒光信號進(jìn)行分析,實(shí)現絕對定量。

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圖3.數字PCR熒光信號

紅黃藍綠各代表不同的檢測靶標,同一張芯片可以檢測多種靶點(diǎn)


相比傳統熒光定量PCR,數字PCR擁有高的檢測靈敏度(是熒光定量PCR的100倍以上,降低了“漏檢"風(fēng)險)、特異性和精確性,并且無(wú)需標準品可實(shí)現定量,是真正的絕對定量技術(shù)。

數字PCR平臺定量

1)無(wú)需標準品,只需擴增檢測未知樣本即可。

2)數據分析可視化的圖片,無(wú)需數據統計,直接呈現待檢樣本的濃度(copies/μL)。

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qPCR和dPCR的差異主要在于是否需要分區檢測。qPCR不需要分區檢測,20μL反應體積中包含待檢測的靶標分子和反應試劑,該反應體系置于200μL的PCR反應管中擴增檢測信號;dPCR需要將20μL的反應體積(包含待檢分子和反應試劑)分到2萬(wàn)多個(gè)體積只有1nL左右的微反應單元,實(shí)現數字化分割。數字PCR的分區擴增提高了PCR檢測靈敏度和精準性。

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表1.數字PCR與熒光PCR對比


那么,如何將qPCR體系轉移到dPCR平臺,實(shí)現PCR檢測結果的精準性和靈敏度?從檢測原理上看dPCR的分區擴增保證了PCR檢測的靈敏度和精準性,而qPCR可以通過(guò)加大待檢樣本的體積來(lái)提高檢測的靈敏度和特異性,但是這種方法提高的靈敏度和特異性是有限的。目前,qPCR已經(jīng)有大量成熟的檢測試劑盒(包括科研、醫療等),而dPCR技術(shù)具有更高的檢測靈敏度和精準性,如果把目前qPCR檢測體系轉移到dPCR平臺就可以更快地實(shí)現PCR檢測的靈敏度和精準性。

實(shí)現該方法的轉移需要滿(mǎn)足3個(gè)條件:

1)qPCR試劑盒發(fā)光原理和dPCR檢測的原理一樣;

2)dPCR平臺開(kāi)放,兼容第三方的試劑盒或者試劑;

3)適度的體系優(yōu)化即可實(shí)現精準定量。

qPCR體系轉移到dPCR平臺會(huì )帶來(lái)2大優(yōu)勢:

1)不需要標準品,既可實(shí)現絕對定量;

2)提高了qPCR試劑盒檢測的靈敏度和精準性。


BioDigital數字PCR“三明治"芯片,采用玻璃基底的微流控技術(shù)實(shí)現樣本的穩定分區,保證了每個(gè)液滴的獨立性和穩定性,具有更高的檢測靈敏度和準確性。另外,BioDigital數字PCR平臺具有很好的開(kāi)放性,支持第三方qPCR試劑盒或試劑的轉移,通過(guò)一步簡(jiǎn)單的體系優(yōu)化甚至不需要優(yōu)化的情況下,qPCR試劑盒就可以在BioDigital平臺上實(shí)現精準的定量。


#案例一

小海龜科技BioDigital數字PCR平臺兼容性測試——兼容客戶(hù)自由的試劑盒、平臺開(kāi)放

測試內容:使用A客戶(hù)自有體系(包括檢測緩沖液、引物探針和模板)搭配小海龜數字PCR平臺進(jìn)行測試;

測試目的:使用客戶(hù)成熟的熒光定量/數字PCR檢測體系,測試其與小海龜數字PCR平臺的兼容性,協(xié)助客戶(hù)將檢測體系遷移至我們的平臺,節省體系重新開(kāi)發(fā)的成本;

測試結果:重復8次測試(包括陰性和陽(yáng)性),平均有效液滴數19000+,表明客戶(hù)體系與小海龜數字PCR平臺可兼容,液滴生成未受影響;下圖為測試結果(原始圖和一維散點(diǎn)圖),結果表明數字PCR腔室分割正常,陽(yáng)性液滴分布均勻,一維散點(diǎn)圖陰陽(yáng)性界限明顯。

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#案例二

小海龜科技多重熒光、低檢出限、梯度稀釋驗證

測試內容:使用小海龜數字PCR通用試劑盒,結合B客戶(hù)自建的檢測體系(引物探針)對小海龜數字PCR平臺進(jìn)行測試驗證;

測試目的:測試B客戶(hù)自建體系與平臺的兼容性,并驗證平臺檢測性能(線(xiàn)性、低檢出限等);

測試結果:客戶(hù)自建引物探針體系可兼容小海龜數字PCR平臺,多重PCR體系陰陽(yáng)性分簇良好。根據測試結果,小海龜數字PCR平臺在1-1000copies/μL濃度范圍內線(xiàn)性度佳(R2=0.999947),低檢出限可達1copies/μL。

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#案例三

核酸標準品定值

測試內容:使用C客戶(hù)自建體系,結合小海龜數字PCR通用試劑盒,對客戶(hù)提供的核酸標準品進(jìn)行定值;

測試結果:客戶(hù)自建體系可適配小海龜數字PCR平臺,通過(guò)多次重復測試得出待測標準品濃度為2697.83±46.70copies/μL。

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小海龜科技BioDigital•青 數字PCR檢測服務(wù)

1)科研服務(wù)

拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究、二代測序文庫定量/結果驗證、LncRNA/circRNA表達分析、單細胞基因表達分析(注:客戶(hù)已經(jīng)自建qPCR引物探針體系)

2)腫瘤基因檢測

已開(kāi)發(fā)40余款BioDigital數字PCR液態(tài)活檢試劑盒

3)工業(yè)客戶(hù)服務(wù)

標準品定值、病毒載體定量

BioDigital•青 數字PCR檢測報告(部分數據展示)

BioDigital•青數字PCR檢測報告展示芯片熒光信號圖、1D散點(diǎn)圖和樣本的拷貝數濃度


樣本

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NTC

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表2.檢測結果,軟件直接呈現檢測樣本的濃度

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