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技術(shù)文章
蛋白免疫印跡（WB）是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測特定樣品或提取物中某種特定蛋白的方法。聚丙烯酰胺凝膠緊貼著(zhù)膜放置，常用的膜是硝酸纖維素或PVDF（聚偏乙烯氟化物），在電流的作用下蛋白質(zhì)從凝膠遷移到膜上并且被固定。膜是凝膠蛋白質(zhì)的復制品，然后可以與抗體結合后進(jìn)行染色。免疫印跡（WB）是一項通過(guò)凝膠電泳按照分子量大小分離蛋白，然后再利用特異性抗體識別這些蛋白的技術(shù)。它是對蛋白進(jìn)行定性和相對定量的重要檢測工具。
您在WB實(shí)驗時(shí)是否遇到無(wú)信號、高背景、多帶等問(wèn)題？小編接下來(lái)將一一為您呈現這些問(wèn)題的常見(jiàn)原因和解決方案。
Chapter1
無(wú)信號常見(jiàn)原因和解決方案
WB實(shí)驗時(shí)出現無(wú)信號或信號弱現象，小艾歸納整理發(fā)現，主要是靶標自身特性和WB實(shí)驗流程中的樣本制備、轉膜、封閉、抗體孵育、洗膜和檢測等具體實(shí)驗細節問(wèn)題會(huì )導致這一現象。接下來(lái)小艾跟大家詳細扒一扒具體細節有哪些。
1.靶點(diǎn)特性導致無(wú)信號的常見(jiàn)原因及解決方案
▼ 組織或細胞中靶標蛋白含量低導致無(wú)信號或信號弱
可通過(guò)如下建議解決：
參考文獻或數據庫數據（例如The Human Protein Atlas）等，確認靶標蛋白是否在待檢組織或細胞中表達。我們總結了41個(gè)有表達特異性的熱門(mén)靶標表達信息，供大家參考（附錄1）。
增加上樣量，至少上樣20-30μg蛋白。
濃縮使信號大化（例如檢測核蛋白要用核裂解物；檢測膜蛋白用膜裂解液，超速離心分離膜蛋白）。我們總結了58個(gè)熱門(mén)靶標亞細胞定位信息，及其陽(yáng)性對照供大家參考（附錄2）。
參考文獻或產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，誘導增加靶標蛋白表達。很多靶標蛋白需要藥物誘導或其它特殊處理，其含量才能達到WB檢測范圍，我們整理了17個(gè)熱門(mén)靶標蛋白在不同細胞系中藥物處理信息，及對應產(chǎn)品供大家參考（附錄3）。
選擇確認表達靶標蛋白的樣本作為陽(yáng)性對照（可參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中提供的陽(yáng)性對照）。
附錄1 熱門(mén)靶標蛋白表達及陽(yáng)性對照
靶標名稱(chēng) | 組織/細胞表達特異性（Uniprot） |
Alpha-synuclein | •Alpha-synuclein主要在大腦中表達，在中樞神經(jīng)系統的突觸前末梢高度表達。 |
•在除肝臟外的組織中也有少量表達。 | |
BDNF | •BDNF在海馬、杏仁核、大腦皮層和小腦等腦組織中高度表達。 |
•BDNF也表達于心臟、肺、骨骼肌、睪丸、前列腺和胎盤(pán)中。 | |
Caspase-3 /cleaved Caspase-3 | •在肺、脾、心臟、肝臟和腎臟中高度表達。 |
•腦和骨骼肌內中水平表達，睪丸低水平表達。 | |
•在許多細胞系中表達，在免疫系統細胞中的表達最高。 | |
?點(diǎn)擊此處查看更多熱門(mén)靶標組織/細胞表達特異性 | |
附錄2 熱門(mén)靶標蛋白亞細胞定位及陽(yáng)性對照
靶標名稱(chēng) | 蛋白亞細胞定位（Uniprot） | 陽(yáng)性對照 |
Alpha-synuclein | 細胞膜，細胞質(zhì)，細胞核；也分泌于細胞連接、突觸和多巴胺能神經(jīng)元膜結合處。 | •WB：HAP1、HEK293-T細胞裂解液 ；人、大鼠腦組織裂解液 ；重組人Alpha-synuclein蛋白（?ab51189） 。 |
BDNF | 分泌型 | •WB：重組人/小鼠/大鼠BDNF蛋白（?ab9794） ；人，大鼠和小鼠的腦，海馬和小腦組織裂解液 |
BrdU | 細胞核 | •IHC：來(lái)自BrdU 處理的小鼠的未染色切片(?ab129956)。 •ICC：BrdU處理的HeLa 細胞。 |
附錄3 熱門(mén)靶標蛋白陽(yáng)性對照及藥物處理條件
靶標名稱(chēng) | 細胞系 | 試劑處理 | 產(chǎn)品 |
c-Fos | HeLa | 血清饑餓36小時(shí)，20% FBS（2小時(shí)） | ?ab214672 |
Jurkat | 血清饑餓過(guò)夜，PMA（200 nM， 4 小時(shí)） | ||
RAW 264.7 | 血清饑餓過(guò)夜，PMA（200 nM， 4 小時(shí)） | ||
Cleaved Caspase-3 | HAP1 | 星形孢菌素（2 μM， 24小時(shí)） | ?ab32042 |
HeLa | 星形孢菌素（2 μM， 24小時(shí)） | ||
cleaved N-terminal DFNA5 / GSDME | SH-SY5Y | Etoposide（60 μM ，14小時(shí)） | ?ab222408 |
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▼組織或細胞中修飾后（磷酸化、乙?；头核鼗龋┑陌袠说鞍缀康?，可導致無(wú)信號或信號弱現象
可通過(guò)如下建議解決：
通常情況下，在未處理的組織或細胞中，大部分翻譯后修飾狀態(tài)下的蛋白含量較少。
參考文獻或產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，誘導增加靶標蛋白含量。我們整理了25個(gè)熱門(mén)靶標，在不同細胞系中檢測其翻譯后修飾形式，需藥物處理條件及對應的產(chǎn)品，供大家參考（附錄3）。
裂解緩沖液中使用相應去修飾酶抑制劑。（例如靶蛋白磷酸化檢測，裂解液中需增加磷酸酶抑制劑）
陽(yáng)性對照（參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中誘導試劑和條件，處理樣本。）
附錄3 翻譯后修飾靶標蛋白陽(yáng)性對照及藥物處理條件
靶標名稱(chēng) | 細胞系 | 試劑處理 | 產(chǎn)品 |
eNOS(phospho S1177) | HUVEC | Pervanadate（100 uM，10分鐘） | ?ab215717 |
JAK2(phospho Y1007 + Y1008) | Jurkat | Pervanadate（50 mM ，5分鐘） | ?ab32101 |
C6 | Pervanadate（50 mM，5分鐘） | ||
Hepa1-6 | Pervanadate（100 µM，30分鐘） | ||
MEF | Pervanadate（100 µM，30分鐘） | ||
MLKL(phospho S345) | L-929 | 20 ng/ml TNF alpha，100 nM Smac mimetic和20 µM z-VAD（8小時(shí)） | ?ab196436 |
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注：具體細胞系處理信息請參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
▼靶標蛋白是分泌型蛋白，檢測時(shí)分泌到細胞外，若檢測的樣本為全細胞裂解液，會(huì )出現無(wú)信號或信號弱現象
可通過(guò)如下建議解決：
使用 Brefeldin A（BFA）抑制蛋白分泌，提取全細胞裂解液。
如果全細胞裂解液中檢測不到靶蛋白，建議提取細胞培養上清中的蛋白。
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