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技術(shù)文章
一、 細胞培養基的概念和原理
合成細胞培養基是用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養基，組分穩定，主要包括糖類(lèi)、必需氨基酸、維生素、無(wú)機鹽類(lèi)等。自1950 年199 細胞培養基問(wèn)世以來(lái)，合成細胞培養基發(fā)展至今已有幾十種，除了沿用半個(gè)世紀的基礎合成細胞培養基之外，近年來(lái)還出現了營(yíng)養成分更加豐富的低血清細胞培養基。
由于細胞種類(lèi)和培養條件不同，適宜的合成細胞培養基也不同，在動(dòng)物細胞培養中常用基礎細胞培養基有6～7 種，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。
由于天然培養基的一些營(yíng)養成分不能被合成細胞培養基代替，因此一般需在合成細胞培養基中添加5％～10％的小牛血清。小牛血清的加入對細胞培養非常有效，但小牛血清的成分復雜，這對培養產(chǎn)物的分離純化和檢測會(huì )帶來(lái)一定的不便，為減少小牛血清的影響，開(kāi)發(fā)了營(yíng)養成分更加豐富的低血清細胞培養基，可以將小牛血清的使用量降低到1～3％。
無(wú)血清細胞培養基（serum free medium， SFM）是指在使用中無(wú)需添加血清的細胞培養基，且其組成成分不含有任何動(dòng)物組分。按照其組分分類(lèi)，還可以分為無(wú)動(dòng)物組分無(wú)血清細胞培養基和化學(xué)限定無(wú)血清細胞培養基，前者組分中可能含有某些植物來(lái)源成分，而后者由化學(xué)成分明確的組分組成。
其中，無(wú)動(dòng)物組分無(wú)血清細胞培養基是目前在生物制藥行業(yè)中應用廣泛的，它提高了細胞培養的質(zhì)量，避免了使用血清帶來(lái)的麻煩。目前，已有多種無(wú)血清培養基上市，如雜交瘤細胞無(wú)血清培養基、CHO細胞無(wú)血清培養基、Vero細胞無(wú)血清培養基和NS0 細胞無(wú)血清培養基等。無(wú)血清培養基通常添加生長(cháng)附加成分，如激素與生長(cháng)因子、低分子營(yíng)養成分和轉鐵蛋白等促細胞生長(cháng)的附加成分，一般包括胰島素、孕酮、硒...酸NA、腐胺、轉鐵蛋白等。
2.1 天然培養基
天然培養基是指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類(lèi)培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養技術(shù)建立早期，體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由于天然培養基制作過(guò)程復雜、批間差異大，因此逐漸被合成培養基所替代。
2.1.1 小牛血清
用于細胞培養的血清主要是牛血清，培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因主要是來(lái)源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過(guò)長(cháng)時(shí)間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。小牛血清取自出生10～30 天的小牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之內的新生牛；胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)很高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。
牛血清對絕大多數哺乳動(dòng)物細胞都是適合的，但并不排除在培養某種細胞時(shí)使用其他動(dòng)物血清更合適。牛血清中含有豐富的細胞生長(cháng)必須的營(yíng)養成份，具有極為重要的功能。
1) 血清主要作用
(1) 提供基本營(yíng)養物質(zhì)：氨基酸、維生素、無(wú)機物、脂類(lèi)物質(zhì)、核酸衍生物等，是細胞生長(cháng)必須的物質(zhì)。
(2) 提供激素和各種生長(cháng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的 松、地塞米松）、類(lèi)固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長(cháng)因子如成纖維細胞生長(cháng)因子、表皮生長(cháng)因子、血小板生長(cháng)因子等。
(3) 提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過(guò)程中起重要作用。
(4) 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷，對培養中的細胞起到某些保護作用。
2) 優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)
血清是非常復雜的混合物，成分多樣，含有各種生理平衡的分子量差別很大的生物分子，有的對細胞生長(cháng)有促進(jìn)作用，如含有攜帶激素、礦物質(zhì)、微量元素和脂類(lèi)物質(zhì)的轉運蛋白等。血清能夠提供細胞貼壁因子和擴散因子。血清中含有起穩定作用和解毒的因子，能夠維持培養基的pH 值并抑制蛋白酶直接或間接的酶解。但是血清的加入也帶來(lái)了很多問(wèn)題：
(1) 血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類(lèi)生長(cháng)因子、激素和脂類(lèi)等尚未充分認識，這給研究工作帶來(lái)許多困難；
(3) 不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認為是“瓶中惡化"的原因之一。
(4) 對大多數細胞，在體內狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過(guò)程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細胞的生長(cháng)（成纖維細胞）同時(shí)抑制另一類(lèi)細胞生長(cháng)（表皮細胞）。
(5) 血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來(lái)自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會(huì )影響細胞生長(cháng)，甚至造成細胞死亡。
(6) 取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響。
(7) 血清的使用使得實(shí)驗和生產(chǎn)的標準化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。
(8) 大規模生產(chǎn)中，血清來(lái)源越來(lái)越困難，價(jià)格昂貴，是構成生產(chǎn)成本的主要部分之一。
(9) 為了使與傳染源相關(guān)的風(fēng)險減少到很低，存在多個(gè)國家間限制進(jìn)出口生物材料的國際法規。
2.1.2 水解乳蛋白
水解乳蛋白（Lactalbumin Hydrolysate ）為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。既可用于細菌微生物培養，又可用于動(dòng)物細胞培養。細胞培養中一般為0.5％水解乳蛋白（經(jīng)平衡鹽溶解）與合成培養基（如MEM）按1:1混合使用。
目前在生產(chǎn)中主要用于低鼠腎細胞等細胞的培養和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產(chǎn)帶來(lái)一定的風(fēng)險。首先由于水解乳蛋白系或者制品帶來(lái)風(fēng)險。其次水解乳蛋白及含有動(dòng)物組分培養基的使用，使生物制品下游處理變得復雜，這對于蛋白質(zhì)藥物顯得更加重要。因為從動(dòng)物細胞中生產(chǎn)生物藥品，其面臨的最大困難就是如何去除內源或同源蛋白。不確定的成分，像動(dòng)物肽類(lèi)物質(zhì)的引入，勢必會(huì )增加提取、分離、純化的步驟，一方面使成本提高，另一方面也會(huì )影響生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量。
2.2平衡鹽溶液
一些BSS含有的Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成分，同時(shí)參與許多重要的細胞功能活動(dòng)。但它們有使細胞凝集的作用，在配制分散細胞的消化液和特殊用途的細胞洗滌時(shí)，宜采用Ca2+、Mg2+含量較低的Dulbecco液或無(wú)Ca2+、Mg2+的D-Hanks液，或者PBS液。
2.3基礎培養基
2.3.1 概述
基礎細胞培養基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。人工合成培養基使用時(shí)還需添加一定量的血清使細胞生長(cháng)和繁殖
2.3.2 組成及作用
氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同的細胞對氨基酸的需求各異，但幾種必需氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養液提供，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸，細胞可以自己合成，或通過(guò)轉氨作用由其他物質(zhì)轉化而來(lái)。絕大部分細胞對谷氨酰胺有較高的要求，因為谷氨酰胺是作為能源
及碳源物質(zhì)同時(shí)被細胞利用，是是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細胞生長(cháng)不良而死亡，所以各種培養液中都含有較多的谷氨酰胺。細胞所能利用的氨基酸是L型同分異構體，D型氨基酸不能被利用。
維生素：維持細胞生長(cháng)的一種生物活性物質(zhì)，對細胞代謝有重大作用。它們在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，沒(méi)有它們，酶便沒(méi)有活性，代謝活動(dòng)將無(wú)法進(jìn)行。維生素分為水溶和脂溶兩大類(lèi)的培養液中直接采用ATP和fu酶A。
葡萄糖：大部分培養基都以葡萄糖作為能量來(lái)源之一。
無(wú)機鹽：維持培養基滲透壓平衡，參與細胞的代謝活動(dòng)。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是細胞外液中最主要的陽(yáng)離子，對維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K+主要分布在細胞內液，細胞內K+對于激活某些酶是必需的，并在調節細胞內環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+在細胞外液中的作用是將組織內部細胞之間相互粘著(zhù)，在細胞內參與許多重要的細胞生理活動(dòng)，如傳導、參與肌肉細胞收縮等。在懸浮培養時(shí)，為了減少細胞的聚集和附著(zhù)，要減少Ca2+的濃度。
Mg2+是構成細胞間質(zhì)的重要成分，對于細胞間相互穩定結合有很重要的意義。磷的化合物對細胞物質(zhì)代謝和生理功能調控有重要作用。
其他成分：肽、核苷、嘌呤等?？蓭椭毎目寺』囵B及維持某些特殊細胞系的生長(cháng)。
2.4 低血清細胞培養基
2.4.1 概述
營(yíng)養豐富的培養基是維持細胞活性及高密度生長(cháng)的基礎，營(yíng)養缺乏容易引起細胞凋亡，新生牛血清中所含大部分營(yíng)養成分可以通過(guò)化學(xué)成分明確的營(yíng)養物質(zhì)如氨基酸維生素等成分組合取代。低血清培養基營(yíng)養成分大優(yōu)于基礎培養基，僅需添加1％～5％新生牛血清，而對細胞生長(cháng)、增殖、形態(tài)、活性和功能沒(méi)有影響甚至有所改善。
在國外低血清培養基早已有之，如Gibco等。但是他們的低血清培養基是在基礎培養基中選擇性的加入重組胰島素（recombinant insulin）、人源轉鐵蛋白（human (holo) tran- sferrin）以及牛血清白蛋白等，有些還包含一些生長(cháng)因子，這些重組蛋白和動(dòng)物來(lái)源成分對生物制品的安全性有很大影響。成本低。
2.4.3 應用案例
采用199(SLM)、MEM(SLM)和DMEM（SLM）低血清培養基分別培養Vero細胞、BHK21細胞和CHO細胞，新生牛血清用量可以從10％降至3％，減少新生牛血清使用批次和批間差的影響，減少生物制品純化損失，減少由于不確定蛋白或者其它血清組分帶來(lái)干擾和差異的風(fēng)險，提高制品安全性。低血清培養基可以在方瓶、3L轉瓶、15L 轉瓶及生物反應器中培養細胞，在疫苗生產(chǎn)中可以達到低血清高密度的培養效果。
低血清培養基營(yíng)養成分優(yōu)于基礎培養基，易使細胞增殖迅速，代謝旺盛，代謝產(chǎn)物對細胞有不良影響，易產(chǎn)生細胞老化脫落現象。因此需要適當增加換液次數，增加傳代頻率。獲取同樣的細胞量，用低血清培養基將比用傳統培養基縮短近1/3 的時(shí)間，可提高生產(chǎn)效率。
采用199(SLM)低血清培養基培養Vero細胞分泌狂犬疫苗病毒，滴度明顯高于采用199 培養基傳統培養獲得的滴度。采MEM(SLM)低血清培養基BHK21細胞，在本實(shí)驗情況下12 代內細胞形態(tài)和致密度均優(yōu)于MEM培養基傳統培養情況，因而可以預期其產(chǎn)生的口蹄疫、甲肝等疫苗生產(chǎn)的病毒產(chǎn)量將提高。低血清培養基用于反應器Vero細胞狂犬疫苗的生產(chǎn)，實(shí)踐證明效果良好。采DMEM（SLM）低血清培養基添加1％小牛血清在轉瓶中培養CHO細胞生產(chǎn)EOP，可提高收液次數，每次收液表達量明顯提高。
2.5無(wú)血清細胞培養基
2.5.1 概述
無(wú)血清培養基是用來(lái)在無(wú)血清條件下生長(cháng)特殊類(lèi)型的細胞或進(jìn)行專(zhuān)門(mén)應用的培養基。一般是由基礎培養基和替代血清的補充因子組成。無(wú)血清培養基中沒(méi)有添加血清，但含有個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。無(wú)血清培養基與無(wú)蛋白培養基的區別在于培養基中沒(méi)有添加蛋白，但含有一些動(dòng)物或植物來(lái)源成分，如低分子量肽的水解物。還有一種化學(xué)限定培養基，培養基中不含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結構的組分，所有成分均有已知的化學(xué)結構。
優(yōu)點(diǎn)：
1） 未知組分少；
2） 培養基中不存在血清中的抗體、補體等成分，對培養細胞影響??；
3） 雜蛋白含量少，生產(chǎn)的產(chǎn)品后期處理較容易，例如疫苗生產(chǎn)由于人用疫苗需要純化減少雜蛋白，純化過(guò)程中成本消耗很大，疫苗的損失也很大；
4） 無(wú)血清培養既可以實(shí)現細胞的大規模懸浮培養，增加培養液的利用率，可以采用發(fā)酵罐培養減少了人力消耗。
缺點(diǎn)：
目前為止不是所有的細胞都能在無(wú)血清培養基中培養。無(wú)血清培養基的某些組分價(jià)格昂貴，導致無(wú)血清無(wú)法工業(yè)推廣的主要原因
3.2細胞培養基的檢測方法
3.2.1 澄清度
水是細胞培養基的溶劑。細胞培養基中的營(yíng)養成分只有溶解于水才能被細胞吸收攝取，細胞才能生長(cháng)增殖，因此細胞培養基是否溶解以及培養液是否透明澄清直接影響培養基使用。該項目是通過(guò)對水溶解后的細胞培養基的澄清度檢查，判斷細胞培養基的澄清度。 按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅸ B進(jìn)行。
3.2.2 pH 值
哺乳類(lèi)動(dòng)物細胞生長(cháng)需要合適的酸堿度，pH過(guò)高或者過(guò)低都會(huì )導致細胞死亡。pH值的測定也可以檢查細胞培養基的批間差。清大天一標準規定取規定量供試品，用注射用水（水溫20℃-30℃）溶解至1L，加入規定量碳酸氫鈉到上述溶液中，用與細胞培養基溶液pH值相近的兩點(diǎn)標準緩沖液校準后的酸度計進(jìn)行測定。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進(jìn)行；加入規定量的碳酸氫鈉到上述溶液中，按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進(jìn)行
3.2.3 干燥減量的質(zhì)量分數
細胞培養基具有吸濕性，在空氣中放置水分會(huì )很快升高，干燥減量的質(zhì)量分數表示產(chǎn)品中含濕量。細胞培養基是有菌制劑，其豐富的營(yíng)養成分有利于微生物生長(cháng)，控制細胞培養基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持細胞培養基的養分。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅷ L 干燥失重測定法進(jìn)行。
3.2.4 滲透壓
溶劑通過(guò)半透膜由低濃度向高濃度溶液擴散的現象稱(chēng)為滲透，阻止滲透所需施加的壓力，稱(chēng)為滲透壓。細胞必須生活在等滲環(huán)境中，動(dòng)物細胞借助K＋、Na＋維持滲透平衡。大多數細胞對滲透壓有一定的耐受性。但是培養液滲透壓過(guò)高容易使細胞脫水wei縮，培養液滲透壓過(guò)低容易使細胞膨脹破裂，因此要控制培養基的滲透壓范圍。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅸ G 滲透壓摩爾濃度測定法進(jìn)行。
3.2.5 細菌內毒素
細菌內毒素是許多病原性細菌所產(chǎn)生的毒素。它的特殊性在于不是細菌或細菌的代謝產(chǎn)物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來(lái)的一種具有生物活性的物質(zhì)。培養基細菌內毒素過(guò)高，對生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程藥品等注射用的藥品都需要檢查細菌內毒素。 因此本項目的檢驗符合生物制品質(zhì)量控制要求。常規細胞培養基的細菌內毒素標準定為＜10 EU/ml。稱(chēng)取本品規定量（見(jiàn)表4-12）的1/100，加入細菌內毒素檢查用水10 mL溶解，吸取該溶液0.1 mL加細菌內毒素檢查用水3.9 mL，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅺ E 細菌內毒素檢查法中的凝膠法進(jìn)行。
3.2.6 微生物限度
細胞培養基不是無(wú)菌產(chǎn)品，其中的微生物在一定條件下會(huì )吸收細胞培養基中的營(yíng)養物質(zhì)滋生繁殖，導致細胞培養基變質(zhì)失效?？刂萍毎囵B基中細菌和霉菌，是延長(cháng)細胞培養基有效期的方法之一。清大天一在參考《中華人民共和國藥典》2005版二部附錄第100頁(yè)的口服給藥制劑的微生物限度標準，并嚴于該標準，規定細胞培養基產(chǎn)品的細菌數每1g不得超過(guò)200個(gè)，霉菌數每1g不得超過(guò)50個(gè)。
稱(chēng)取樣品1 g，加入無(wú)菌純化水10 mL溶解，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅺ J 微生物限度檢查法進(jìn)行，檢查項目為細菌數、霉菌數。檢查法采用平皿法。
3.2.7 細胞生長(cháng)試驗
這是一個(gè)性能特性表述的要求。細胞培養基的功能就是培養哺乳類(lèi)動(dòng)物細胞，因此經(jīng)過(guò)細胞培養效果的檢驗是產(chǎn)品質(zhì)量?jì)?yōu)劣的直觀(guān)表述，這也是很多生物制藥用戶(hù)要求的一項指標。目前國內尚無(wú)細胞培養和計數的法定方法，可參考《體外培養的原理與技術(shù)》中細胞計數法中論述的內容給出。按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制培養液進(jìn)行細胞培養，前四天用含10％小牛血清的培養液培養，觀(guān)察細胞形態(tài)并計數，檢查細胞培養基是否有促生長(cháng)的能力。后三天用不含小牛血清的培養液維持培養，觀(guān)察細胞形態(tài)并計數，檢查細胞培養基中是否有不利細胞生長(cháng)的毒素。本試驗用細胞為VERO細胞。
四、細胞培養基的使用方法細胞培養基的種類(lèi)繁多，細胞培養方式也較多，如何正確地使用培養基及很大程度地保持培養基的營(yíng)養以維持細胞的生長(cháng)，對每個(gè)培養者都很重要。培養基的使用依不同的培養基種類(lèi)、培養方式、細胞種類(lèi)的不同而存在差異。
4.1 細胞培養液的構成
細胞培養液指細胞生長(cháng)的液體環(huán)境，一般指培養液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養液。
4.1.1 細胞培養基&血清模式
血清對于在傳統培養基配方中生長(cháng)和增殖的大多數細胞系來(lái)說(shuō)是需要的，因為大多數單獨的培養基并不能提供細胞生長(cháng)所需要的全部營(yíng)養，如MEM培養基，較為常用的量為5％～10％的比例，而特殊的低血清培養基血清量可降至3％左右，細胞的形態(tài)和功能不受影響。
4.1.2 細胞培養基&乳歐液模式
化學(xué)合成培養基現雖已大規模使用，但在某些培養領(lǐng)域水解乳蛋白仍在使用，以補充培養液中缺乏的氨基酸、小肽物質(zhì)。較為常用的方式是用漢氏（Hanks’ BSS）或歐式(Earle’s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白（一般為5‰濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學(xué)合成培養基（一般為MEM）按比例混合使用（如1：1）。
4.1.3 細胞培養基&各類(lèi)添加劑（生長(cháng)因子等）模式
成分復雜的培養基還含有許多化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、丙酮酸及脂類(lèi)等。已發(fā)現當培養基中的血清濃度減少時(shí)，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細胞的克隆化培養及維持某些特殊細胞系的生長(cháng)。激素和生長(cháng)因子在大多數常規培養基的配方中都沒(méi)有注明，但在無(wú)血清培養基中通常要加入它們，用其來(lái)代替血清中的激素能增加多種不同類(lèi)型細胞的貼瓶率；生長(cháng)因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF－1和IGF－2及白介素等，生長(cháng)因子和細胞因子有著(zhù)廣泛的特異性，一般與激素或其它物質(zhì)起相互協(xié)同或加成作用。另一種常見(jiàn)的添加物就是血清替代物，目前已有許多可替代傳統培養液中血清成分的商業(yè)產(chǎn)品，其穩定性較好，但批次間仍有差別，產(chǎn)品的成分也不很確定。
4.2細胞培養基配制
4.2.1 干粉培養基原倍液的配制
1）配制過(guò)濾除菌的細胞培養基
(1) 閱讀培養基使用說(shuō)明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等）。
(2) 根據所需將培養基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內殘留培養基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。
(3) 加入規定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質(zhì)。
(4) 輕微攪拌溶解，加注射用水至規定體積。
(5) 用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調pH至所需值。
(6) 用0.22 μm濾膜正壓過(guò)濾除菌。
(7) 溶液應在2℃－8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養基包裝袋上的說(shuō)明書(shū)。
2）配制可高壓滅菌細胞培養基
(1) 根據所需將培養基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內殘留培養基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解
(2) 在121℃、15psi下滅菌15分鐘。
(3) 待溶液冷卻至室溫，加入無(wú)菌0.2 mol / L L－谷氨酰胺溶液規定體積、無(wú)菌7.5％（w/v）碳酸氫鈉溶液規定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規定體積，混勻。
(4) 如果必要，用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調pH至所需值。
(5) 溶液應在2℃－8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養基包裝袋上的說(shuō)明書(shū)
4.2.2 注意事項
1） 細胞培養用水一般為三蒸水（經(jīng)石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫藥生產(chǎn)上一般為注射用水。
2） 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因為包裝一旦打開(kāi)，組分可能會(huì )變質(zhì)或因受潮而結團。
3） 溶解干粉培養基時(shí)先加入終體積90％－95％的培養用水，添加劑加完后再補足。
4） 如需添加的組分較多時(shí)，某一組分溶解后，再添加另一組分。
5） 待培養基溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。
6） 所有成分溶解后，培養基應立即過(guò)濾或高壓除菌，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。
7） 在過(guò)濾除菌時(shí)，一般情況下應調pH比所需值低0.1～0.2個(gè)單位，因過(guò)濾除菌后，pH值會(huì )升高約0.2。
8） 在細胞培養過(guò)程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應降低一些。
培養基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22 um微孔濾膜過(guò)濾除菌。與過(guò)濾相比，高壓滅菌的工作強度小，相對便宜，失敗率低，但易造成營(yíng)養成分的流失。
4.3.1 高壓滅菌
某些培養基（如MEM）可進(jìn)行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓滅菌后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺
為保證高壓滅菌的效果，滅菌設備的驗證很關(guān)鍵，可高壓滅菌的培養基在121℃、15psi，15分鐘的條件下可達到滅菌效果及營(yíng)養成分的最小損失，因此不需將滅菌時(shí)間延長(cháng)。
4.3.2 過(guò)濾滅菌
大多數培養基采用0.1～0.2 μm孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾滅菌，并且已成為培養基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養基的營(yíng)養損失。
4.4 細胞培養液的儲存
細胞培養液的儲存條件一般為2－8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點(diǎn)：
1） 過(guò)濾后的培養液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養液要盡快使用，一般在2－3周內使用完。培養液中的L-谷氨酰胺是不穩定的，不同溫度L－谷氨酰胺的降解。
2） 滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養基溶液，一般可在4℃保存6～9個(gè)月，也可冷凍保存，用時(shí)解凍
3） 高壓除菌后的培養基應置4℃保存，不能因為其可耐受高溫而忽略?xún)Υ鏈囟取?/p>
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