胰酶使用注意：

1、在使用胰酶細胞消化液的過(guò)程中要特別注意避免消化液被細菌污染。

2、胰酶細胞消化液消化細胞時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，否則細胞鋪板后生長(cháng)狀況會(huì )較差。

貼壁細胞的消化：

1、吸去培養液，用無(wú)菌的PBS、Hanks液或無(wú)血清培養液洗滌細胞一次，以去除殘余的血清

2、加入少量胰酶細胞消化液，略蓋過(guò)細胞即可，根據胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量。室溫放置30秒至2分鐘（不同的細胞消化時(shí)間有所不同）

3、顯微鏡下觀(guān)察，細胞明顯收縮，并且肉眼觀(guān)察培養器皿底部發(fā)現細胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化呈白茫狀；或者用槍吹打細胞發(fā)現細胞剛好可以被吹打下來(lái)。

4、此時(shí)吸除胰酶細胞消化液。加入含血清的細胞培養液，吹打下細胞，即可直接用于后續實(shí)驗如果發(fā)現消化不足，則加入胰酶細胞消化液重新消化。

如果發(fā)現細胞消化時(shí)間過(guò)長(cháng)，未及吹打細胞，細胞已經(jīng)有部分直接從培養器皿底部脫落，直接用胰酶細胞培養液把細胞全部吹打下來(lái)。1000-2000g離心1分鐘，沉淀細胞，盡量去除胰酶細胞消化液后，加入含血清的培養液重新懸浮細胞，即可用于后續實(shí)驗。

常用的細胞消化液為胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使細胞間的蛋白質(zhì)（如細胞外基質(zhì)）水解，改變細胞間的連接，使組織或細胞片分散成單個(gè)細胞，制成細胞懸液用于進(jìn)一步的實(shí)驗。

影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或4℃保存時(shí)間長(cháng)短、是否反復凍融、化凍后存放時(shí)間及溫度等）、消化時(shí)的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等 。

加入胰蛋白酶-EDTA溶液，視細胞瓶的大小加入體積為2ml或更多（依培養器皿的大小而定），以使充分浸潤；

一般消化時(shí)間約為1至3分鐘，肉眼觀(guān)察瓶底由半透明（細胞單層連接成片）轉為透明、點(diǎn)狀（出現細小空隙）時(shí)，棄去細胞消化液，或看見(jiàn)培養瓶壁呈白茫狀即可。并加入適量的培養液終止消化，吹打分散；如見(jiàn)大量細胞片狀脫落，已消化過(guò)頭，則不能頃倒消化液而直接進(jìn)行下一步操作。（消化過(guò)頭，可造成大量細胞從瓶壁上脫下，甚至造成細胞破碎。由于血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑，所以加入培養基可以終止反應。

胰酶配置方法：

1、培養液配制，方便好用，對細胞影響小，并且培養液的ph值正好適合胰蛋白酶的溶解

2、生理鹽水配制，要先調ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力攪拌2-3小時(shí)，調pH 7.8-8.0，過(guò)濾除菌。）

3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：稱(chēng)取胰酶粉末0.1g，先用少許滅菌過(guò)的PBS調成糊狀，然后補足到100ml。置室溫攪拌4小時(shí)或冰箱內過(guò)夜，過(guò)濾滅菌，分裝，4℃保存備用。）; 或是hanks或是D-hanks液配制（1.稱(chēng)取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許D-Hanks 平衡鹽溶液（pH7.2 左右）調成糊狀，然后再補足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時(shí)或冰箱過(guò)夜，并不斷攪拌振蕩；2.次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過(guò)濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存備用，常用濃度為0.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調用碳酸氫鈉溶液調pH 至7.2 左右。）

一般0.45微米的一次性濾器過(guò)濾除菌，至于作用效果，需要消化一次細胞感覺(jué)一下，因為不同廠(chǎng)家的酶不一樣，有的作用溫和，有的作用劇烈。

4、是否需要四度放置過(guò)夜，取決于你的胰酶的純度。過(guò)去的胰酶純度不高，所以難以溶解，需要四度過(guò)夜. 而現在的胰酶純度都很高，就沒(méi)有必要四度過(guò)夜。從理論上來(lái)說(shuō)，四度放置過(guò)夜，給細菌生長(cháng)的機會(huì )，盡管過(guò)濾可以出去細菌，可是出不掉其代謝產(chǎn)物。

胰蛋白酶不溶,有絮狀物的原因，考慮有：

1、過(guò)期或是酶已經(jīng)部分變性

2、溶液ph值不對

3、在沒(méi)過(guò)濾之前的絮狀沉淀是正?，F象，因胰酶多取自動(dòng)物胰腺，沉淀為組織塊，過(guò)濾后即可