技術(shù)文章
胰酶使用注意:
1、在使用胰酶細胞消化液的過(guò)程中要特別注意避免消化液被細菌污染。
2、胰酶細胞消化液消化細胞時(shí)間不宜過(guò)長(cháng),否則細胞鋪板后生長(cháng)狀況會(huì )較差。
貼壁細胞的消化:
1、吸去培養液,用無(wú)菌的PBS、Hanks液或無(wú)血清培養液洗滌細胞一次,以去除殘余的血清
2、加入少量胰酶細胞消化液,略蓋過(guò)細胞即可,根據胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量。室溫放置30秒至2分鐘(不同的細胞消化時(shí)間有所不同)
3、顯微鏡下觀(guān)察,細胞明顯收縮,并且肉眼觀(guān)察培養器皿底部發(fā)現細胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化呈白茫狀;或者用槍吹打細胞發(fā)現細胞剛好可以被吹打下來(lái)。
4、此時(shí)吸除胰酶細胞消化液。加入含血清的細胞培養液,吹打下細胞,即可直接用于后續實(shí)驗如果發(fā)現消化不足,則加入胰酶細胞消化液重新消化。
如果發(fā)現細胞消化時(shí)間過(guò)長(cháng),未及吹打細胞,細胞已經(jīng)有部分直接從培養器皿底部脫落,直接用胰酶細胞培養液把細胞全部吹打下來(lái)。1000-2000g離心1分鐘,沉淀細胞,盡量去除胰酶細胞消化液后,加入含血清的培養液重新懸浮細胞,即可用于后續實(shí)驗。
常用的細胞消化液為胰蛋白酶(Trypsin),EDTA等,其功能主要是使細胞間的蛋白質(zhì)(如細胞外基質(zhì))水解,改變細胞間的連接,使組織或細胞片分散成單個(gè)細胞,制成細胞懸液用于進(jìn)一步的實(shí)驗。
影響消化速度的因素較多,主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時(shí)間長(cháng)短、是否反復凍融、化凍后存放時(shí)間及溫度等)、消化時(shí)的溫度(氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等 。
加入胰蛋白酶-EDTA溶液,視細胞瓶的大小加入體積為2ml或更多(依培養器皿的大小而定),以使充分浸潤;
一般消化時(shí)間約為1至3分鐘,肉眼觀(guān)察瓶底由半透明(細胞單層連接成片)轉為透明、點(diǎn)狀(出現細小空隙)時(shí),棄去細胞消化液,或看見(jiàn)培養瓶壁呈白茫狀即可。并加入適量的培養液終止消化,吹打分散;如見(jiàn)大量細胞片狀脫落,已消化過(guò)頭,則不能頃倒消化液而直接進(jìn)行下一步操作。(消化過(guò)頭,可造成大量細胞從瓶壁上脫下,甚至造成細胞破碎。由于血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑,所以加入培養基可以終止反應。
胰酶配置方法:
1、培養液配制,方便好用,對細胞影響小,并且培養液的ph值正好適合胰蛋白酶的溶解
2、生理鹽水配制,要先調ph值7.2到7.4(①胰酶(1:250) 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力攪拌2-3小時(shí),調pH 7.8-8.0,過(guò)濾除菌。)
3、pbs(0.1%胰酶溶液的配制:稱(chēng)取胰酶粉末0.1g,先用少許滅菌過(guò)的PBS調成糊狀,然后補足到100ml。置室溫攪拌4小時(shí)或冰箱內過(guò)夜,過(guò)濾滅菌,分裝,4℃保存備用。); 或是hanks或是D-hanks液配制(1.稱(chēng)取胰蛋白酶粉末置燒杯中,先用少許D-Hanks 平衡鹽溶液(pH7.2 左右)調成糊狀,然后再補足D-Hanks 平衡鹽溶液,攪拌混勻,置室溫4 小時(shí)或冰箱過(guò)夜,并不斷攪拌振蕩;2.次日,先用濾紙粗濾,再進(jìn)行過(guò)濾除菌,分裝入瓶中,低溫冰箱保存備用,常用濃度為0.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸,使用前可調用碳酸氫鈉溶液調pH 至7.2 左右。)
一般0.45微米的一次性濾器過(guò)濾除菌,至于作用效果,需要消化一次細胞感覺(jué)一下,因為不同廠(chǎng)家的酶不一樣,有的作用溫和,有的作用劇烈。
4、是否需要四度放置過(guò)夜,取決于你的胰酶的純度。過(guò)去的胰酶純度不高,所以難以溶解,需要四度過(guò)夜. 而現在的胰酶純度都很高,就沒(méi)有必要四度過(guò)夜。從理論上來(lái)說(shuō),四度放置過(guò)夜,給細菌生長(cháng)的機會(huì ),盡管過(guò)濾可以出去細菌,可是出不掉其代謝產(chǎn)物。
胰蛋白酶不溶,有絮狀物的原因,考慮有:
1、過(guò)期或是酶已經(jīng)部分變性
2、溶液ph值不對
3、在沒(méi)過(guò)濾之前的絮狀沉淀是正?,F象,因胰酶多取自動(dòng)物胰腺,沉淀為組織塊,過(guò)濾后即可